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双缩脲是一种用于分析蛋白质的方法，双缩脲反应的原理是在呈蓝色的碱性硫酸铜溶液存在的情况下，肽键与铜离子结合，生成蓝紫色的化合物，此化合物在540nm的吸光度与肽键的数量呈正比例关系，因此可计算出蛋白质的含量。

双缩脲法测蛋白浓度兼容性亦很好，不受大部分样本中其他成分的影响，但易受铜离子螯合剂的影响。另外，对于血清总蛋白的双缩脲分析，胆红素、脂类、血红蛋白、葡聚糖具有一定干扰作用。

双缩脲法在5～160mg/mL浓度范围内有较好的线性关系。

• 试剂拆封后请尽快使用完！
  
• 蛋白标准配制成溶液后要-20℃保存。

• 仪器准备：酶标仪或分光光度计、移液器、冰箱、冰盒
  
• 试剂准备：纯水、生理盐水
  
• 耗材准备：离心管、吸头、一次性手套、96孔板

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 蛋白标准粉末溶解于蛋白标准配制液后，即获得蛋白标准原液；该原液中含有防腐剂，不影响后续检测，该蛋白标准原液-20℃长期保存；
  
• 待测蛋白和蛋白标准加入双缩脲试剂A后，如果发现检测效果不佳，可以室温放置1h或60℃放置15min，颜色会随着时间的延长而不断加深；
  
• 测定标准曲线时发现随着标准品浓度的增加，吸光度或颜色没有明显变化，可能的原因是样品中含有铜离子螯合剂；
  
• 蛋白浓度低于20mg/mL时，颜色反应呈不明显的蓝色；当大于40mg/mL时，即可呈现明显的蓝紫色反应；
  
• 本试剂盒的线性范围是5～160mg/mL，样品蛋白浓度应大于1mg/mL，以20mg/mL上为宜；如果需测定低浓度蛋白样品（1mg/mL），请选择BCA法蛋白定量试剂盒(货号：HR0329)；
  
• 本制品反应生成的蓝紫色的化合物的吸光度，与试剂批次、pH值、反应温度有关；因此建议，每次测定都做标准对照；
  
• 氨基酸和二肽不发生双缩脲反应，三肽、寡肽和多肽与铜离子的双缩脲复合物，呈粉红色-紫红色，与蛋白质的双缩脲反应结果不同；
  
• 如果没有酶标仪，也可以使用分光光度计测定。使用分光光度计测定蛋白浓度时，每个试剂盒可以测定的样品数量会显著减少；
  
• 检测中发现所有孔都呈暗紫色，可能原因是样品中含有还原剂，应适当透析或稀释样品。

• 取0.25mL蛋白标准配制液C或稀释液加入到40mg的蛋白标准B中，充分溶解后配制成蛋白标准溶液（160mg/mL），配制后可立即使用；溶解后的蛋白标准应-20℃保存。也可根据需要进行稀释，如稀释至40mg/mL；
  
• 将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准孔，加稀释液补足至20μL；
  
• 加适当体积待测蛋白样本到96孔板的样品孔中。
  
• 各孔中加入200μL双缩脲试剂A，室温静置10～15min；
  
• 测定540nm波长处的吸光值，如无540nm，510～562nm之间的波长也可；
  
• 根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。